BM经验总结[干品总重量]

搅拌:

整个WB过程完成后,可能需要重拨某些膜。在这种情况下,可以“刮擦”膜。

这里使用了“可能”一词,但这不是必需的,因此让我们首先分析删除的必要性。

没收将其他人排除在外。从节省时间的角度来看,整个过程需要时间。我不能全力以赴另外,如果剥离条件太强或多次洗脱,则剥离会转移到薄膜表面,抗原会削弱WB末端的信号。另外,如果不洗涤分离缓冲液,则某些成分必须干扰二级抗体的结合。

那么,您需要剥离什么条件?

1)如果蛋白A和蛋白B之间的分子量差异超过5 KDa(大于10 KDa),则可以分离膜(用不同的抗体标记),因此无需重新标记分离膜。有可能

有人将两种抗体混合在一起以标记整个膜,因此操作的前提是非常熟悉这两种抗体的位置,并且每个条带都不干扰可以操作的靶蛋白。。并且在此类抗体下,由于其用途有限,不建议使用。

2)如果两种抗体的来源不同,例如小鼠抗抑制或兔反应,则即使蛋白质非常靠近薄膜,也不一定总是需要将其去除。片刻。

通过依次标记这两种不同的抗体,您可以简单地使用TBST去除表面ECL。时间可以更长(不能丢弃,但可以在中间丢弃,可以在中间更换液体)。3次)??,同一膜直接用二抗标记。

但是,如果其中一种蛋白质太强而无法发育,则每隔两天出现第二种蛋白质时可能会发生干扰(可能强弱)。但是,只要这两种蛋白质的大小不相同或彼此连接,就可以最后追踪它们。

3)如果两种抗体的来源相同,或者特定蛋白质和总蛋白质被磷酸化,则可能无需提取。

磷酸化的抗体通常具有较弱的识别能力(与总蛋白相比),因此信号通常不会太强,此时仅需进行简单漂洗即可。但是,磷酸化后的标记顺序必须是标准蛋白质。

避免以前的提取主要是为了节省时间。实际上,如果存在前两点或三点,则个人将继续使用提取。

只需冲洗缓冲液,先用TBST冲洗3次,再用二抗冲洗。但是,如果时间紧迫,它将被跳过。

至少有三种删除电影的方法。

A.用TBST清洗膜。洗涤超过8小时后,大多数蛋白质信号都可以去除。排除诸如内部参考之类的多余信号。

然后,如果抗体非常弱,则隔夜孵育相当于去除抗体,不显示新信号,而是洗涤原始信号,并显示板子。

见密理博

PVDF薄膜随附上述配方说明(否,请Google)。如果信号很强,您可以在50度下做出反应。

重要的是要记住巯基乙醇也会挥发,因此您可以考虑暂时添加。

C.当进行IP时,可以看出,特异性吸附到含有低pH甘氨酸-HCl的微珠上的蛋白质可以被洗脱。

同样的原因,0。

1M甘氨酸(pH 2。

5.30分钟)也可用于薄膜剥离。这是最便宜,最有效的薄膜清洁解决方案。

此外,用TBST冲洗(10分钟* 3)后,膜的pH值尽快恢复正常,并且分离缓冲液的其余成分不会干扰二级抗体的标记。

如果初始蛋白质信号太强,提取功率也可以提高到50度提取。